Hádanka alkoholového kvašení a pře o to, zda je kvasinka živá, či neživá (období 1789–1850)

Revoluce v chemii: Lavoisierova analýza kvašení

Kvasinka nebyla dlouho považována za živý organismus. Toto všeobecné přesvědčení se tradovalo ještě na konci 18. století a na počátku 19. století. První výzkumy kvasinek se proto neodehrávaly v laboratořích biologů, ale téměř výhradně chemiků, kterým alkoholové kvašení (neboli fermentace) nedávalo spát. Jedním z prvních byl Antoine-Laurent de Lavoisier.

Byl zakladatelem nového systému mír a vah, objasnil princip hoření a dýchání a zasloužil se o řadu objevů. Tím, že vytvořil základ pro skutečnou laboratorní analýzu, navždy změnil praxi a pojetí chemie, které přinesly pořádek do chaotických staletí středověké alchymie. Lavoisierova práce tak položila základy moderní chemie. Jeho jméno je mezi dalšími 72 jmény významných osobností zapsáno na Eiffelově věži v Paříži.

Lavoisier považoval alkoholové kvašení za jednu z nejvíce mimořádných chemických reakcí. Byl první, kdo byl schopen jasně popsat chemické změny, k nimž při kvašení dochází. To se stalo v roce 1789: „Když je fermentace dokončena, šťáva z hroznů, která byla sladká a plná cukru, se změní (zkvasí) ve vinný nápoj, který již neobsahuje cukr a ze kterého získáváme destilací hořlavou tekutinu, pro kterou jsme přijali arabské slovo alkohol.“ Lavoisier si tenkrát zapsal, že 100 hmotnostních dílů cukru bylo přeměněno na 60,17 dílů alkoholu, 36,81 dílů oxidu uhličitého a 2,61 dílů kyseliny octové. Sestavil též první rovnici alkoholového kvašení:

hroznový mošt = kyselina uhličitá + alkohol

Před francouzskou revolucí působil Lavoisier jako výběrčí daní (což se mu později stalo osudným, viz dále). Nicméně jeho smysl pro přesnost a čísla se obdivuhodně promítl i v chemii. Jeho znalosti z účetnictví a finančních bilancí měly hluboký vliv na jeho přístup k analytickým záznamům. Podívejte se například na jeho zápisy surovin a výtěžků fermentace.

V roce 1794 Lavoisier umírá, aniž by dokončil své experimenty. Uvízl v sítích francouzské revoluce, byl revolučním tribunálem označen za nepřítele lidu a v roce 1794 jeho život skončil na popravišti pod gilotinou. Jeho přítel, matematik Joseph-Louis Lagrange, kterého se kdysi Lavoisier zastal, o něm napsal: „Trvalo jim jen okamžik, aby mu setnuli hlavu, ale sto let nemusí být pro její znovuvytvoření postačující.“ Rok a půl po jeho smrti bylo Lavoisierovo jméno očištěno francouzskou vládou.

Honba Francouzů za kvasinkou

Přestože byl Lavoisier mrtev, nová francouzská vláda i nadále považovala vědecké objasnění alkoholového kvašení za důležité. Stejně jako dnes i tenkrát byly víno a brandy hlavní vývozní komoditou a Francie byla největším producentem vína na světě. Výroba vína však neustále čelila nejrůznějším nástrahám, jejichž biologická povaha byla obestřena rouškou tajemství. Nejenže nikdo neznal podstatu kvašení, ale ani příčinu toho, proč víno zoctovatí (působením octových baktérií) nebo získá špatnou chuť (nejčastější příčinou je kvasinka Saccharomycodes ludwigii, která je rezistentní vůči SO2 a způsobuje tvorbu plynů, zakalení a nepříjemné pachutě).

A tak v roce 1803 nabídl Francouzský ústav pro matematické a fyzikální vědy medaili v hodnotě jednoho kilogramu zlata pro toho, kdo zodpoví otázku alkoholového kvašení. Žádné uspokojivé odpovědi však nikdo nepředložil. Stejná cena byla nabídnuta i v roce 1805, ale později vláda svoji nabídku stáhla, neboť nebyla schopna zaplatit.

L. J. Thenard a J. L. Gay-Lussac a jejich tažení za objasněním kvašení

Louis J. Thenard a Joseph L. Gay-Lussac byli vynikající chemikové. V roce 1803 Thenard upozornil na ložisko, které připomínalo pivovarské kvasnice a které produkovaly všechny kvasící tekutiny. Ukázalo se, že obsahuje dusíkaté sloučeniny, které se při destilaci mění v amoniak. V roce 1810 provedl Gay-Lussac experiment. Uzavřené láhve s hroznovou šťávou přivedl k bodu varu a udržoval je při této teplotě po nějakou dobu. Pak je ponechal po dobu jednoho roku zavřené. Jakmile byly láhve otevřeny, šťáva začala kvasit. Gay-Lussac dospěl k závěru, že kyslík reagoval se šťávou a vytvořil rozpustný ferment* (viz poznámka na konci), který započal kvašení hroznové šťávy. Ve skutečnosti teplo deaktivovalo jak tento ferment, tak i „nerozpustné“ kvasinky.

Později Gay-Lussac zrevidoval Lavoisierovy výsledky a odhadl, že kvašení 100 dílů cukru vede k následující přeměně: 51,34 je převedeno na alkohol a 48,66 na oxid uhličitý. V roce 1815 Gay-Lussac sestavil rovnici alkoholového kvašení, jak ji známe dnes.

C₆H₁₂O₆ → 2 C₂H₅OH + 2 CO₂
glukóza → 2 etanol + 2 oxid uhličitý

Biologové na scéně

Velké dobrodružství za objasněním kvašení mohlo začít. V roce 1825 J. J. Colin potvrdil Thenardovo pozorování a napsal, že kvasinky se tvoří během kvašení a v nepřítomnosti kyslíku podněcují přeměnu cukru na alkohol. Colin byl profesorem chemie, působil v Gay-Lussacově výzkumné skupině a zřejmě byl jedním z posledních chemiků, kteří výrazně zasáhli do objasnění alkoholové kvašení.

Další krok se již odehrával pod mikroskopem. J. B. H. J. Desmazières byl francouzský amatérský mykolog. Zkoumal mikroorganismy žijící v pivu a vínu, publikoval své kresby a v roce 1827 popsal organismy žijící v pivu jako Mycoderma cervisiae (přičemž cervisia, cervesia nebo cerevisia jsou latinská slova pro pivo) a jako Mycoderma vini ty, které byly přítomné ve víně. Některé Desmazièresovy kresby skutečně připomínají kvasinky; rozpoznal je jako jednoduché živé organismy, ale nepřisoudil jim fermentační aktivitu.

Kvasinka žije!

Z velké části byl příští úspěch právě dílem vylepšené mikroskopovací techniky, zejména objektivům se dostalo vylepšení a již měly korekce na chromatické a sférické odchylky. Mezi lety 1836 a 1838 tři nezávislí pionýři vědy ušli dlouhou cestu k zodpovězení prvotních otázek francouzské vlády a předložili důkazy, že kvasinky jsou živé organismy. Byli to Charles Cagniard-Latour, francouzský fyzik a inženýr, Friedrich Traugott Kützing, německý algolog z Halle, a Theodor A. H. Schwann, vynikající německý fyziolog působící v Berlíně.

V roce 1836 Cagniard-Latour pozoroval pivní a vinné kvasinky a popsal je jako drobné kulovité a vysoce organizované organismy, které zřejmě patří do rostlinné říše, a tudíž se nejedná o žádné chemické sloučeniny. To, že se jedná o živé organismy, přisuzoval zejména tomu, že během kvašení se jejich objem dokázal zmnohonásobit, ačkoliv se pod objektivem mikroskopu nepohybovaly. Pomocí nového mikroskopu pozoruhodně přesně odhadl průměr kvasinkových buněk okolo 7 μm. Vyslovil též domněnku, že mohou přeměňovat cukr jen tehdy, jsou-li živé. Byl první, kdo podrobně popsal množení kvasinek, tzv. pučení, stárnutí buněk a tvorbu jizev, které na mateřské buňce zůstávají po oddělení buněk dceřiných. Jeho jedinečné pozorování jizev však upadlo v zapomnění a bylo „znovuobjeveno“ až o 114 let později.

V témže roce pozoroval kvasinky pod mikroskopem také F. T. Kützing a jejich velikost odhadl na 6–9 μm. Jeho názor, že různé druhy fermentace jsou způsobeny různými organismy, byl potvrzen o čtvrt století později Louisem Pasteurem.

Theodor Schwann byl nejslavnější z této trojice průkopnických vědců. Kromě řady objevů na poli buněčné biologie zavedl termín metabolismus a objevil organický původ kvasinek. Na začátku provedl sérii experimentů s baňkami naplněnými roztokem třtinového cukru a kvasinkami, které ve vodní lázni vystavil bodu varu, poté ochladil a postupně do části baněk pustil vzduch, který nejdříve ohřál, zatímco do jiných baněk vehnal vzduch neohřátý. Pouze v baňkách s neohřátým vzduchem začal po 4–6 týdnech inkubace při 13–18 °C proces kvašení. Schwann pozoroval kvasinky také pod mikroskopem. V čerstvém moštu žádné nenašel, ale pokud byl mošt ponechán při 25 °C, kvasinky se zanedlouho objevily. Pozoroval jejich růst a produkci bublinek oxidu uhličitého, když se vzniklý plyn začne rozpouštět.

Jeho závěry byly revoluční a správné: kvasinkové buňky rostou, cukr je zdrojem jejich potravy, při kvašení se uvolňuje etanol, kvasinky vyžadují i dusíkaté látky a uvnitř živých buněk dochází k chemickým reakcím. Schwann konzultoval svůj výzkum s mykologem F. J. F. Meyenem. Původní Schwannův název pro kvasinku byl Zuckerpilz (cukrová houba), pro níž Meyen vytvořil rodové jméno, které bylo doslovným latinským překladem – Saccharomyces se třemi druhy: S. cerevisiae, S. pomorum a S. vini.

Objevy těchto tří vědců byly téměř okamžitě potvrzeny dvěma Francouzi. T. A. Quevenne byl lékárníkem a zjistil, že se v moči diabetiků tvoří ložiska, jejichž vlastnosti byly podobné fermentu, a srovnával je proto s ložisky, která byla nalezena při alkoholovém kvašení různých látek. Učinil také jednoznačné prohlášení, že tato ložiska způsobují kvašení cukru a že kvasinky získané z kvasícího piva jsou samy o sobě velmi aktivní neboli fermentativní.

Pierre J. F. Turpin byl vynikající botanický ilustrátor. V říjnu 1837 strávil dlouhou a chladnou noční seanci ve velkém pivovaru v Lucembursku, aby po celou dobu kvašení mohl odebírat vzorky a sledovat, popisovat a zakreslovat pomocí mikroskopu veškeré změny, které se odehrávaly v kvasícím pivu. Turpin nejenže potvrdil platnost závěrů Charlese Cagniard-Latoura, ale též obohatil zjištění Quevenneho a v roce 1840 publikoval svá pozorování v podobě vědeckých ilustrací zachycujících pučení kvasinek, tj. tvorbu dceřiných buněk z buňky mateřské až do stejné velikosti. Popsal i jejich následné oddělení (nepohlavní rozmnožování) a také rozmnožování pomocí askospor (pohlavní rozmnožování), které zdokumentoval jako spršku výtrusů, které se náhle uvolnily protržením kulovitých buněk.

Krok zpátky: Kvasinka není živý organismus, ale fyzikálně-chemický fenomén

Pozoruhodnou událostí v historii vědy bylo ostré zamítnutí konceptu kvasinky jako živého organismu a kvašení jako výsledku živé povahy kvasinek třemi předními chemiky této doby, F. Wöhlerem, J. von Liebigem a J. J. Berzeliusem. Ani jeden z nich nevěřil v důkazy mikroskopických pozorování a Berlezius dokonce tvrdil, že kvasinky jsou sraženinou oxidu hlinitého. Von Liebig oponoval tím, že určitá katalytická síla je odpovědná za fermentaci a že kvasinky jsou pouze neživým katalyzátorem. Namísto toho, aby pomohl objasnit mechanismus chemických reakcí, zavedl do chemie novou tajemnou sílu. Baron Justus Von Liebig byl jedním z nejvlivnějších vědců své doby a jeho intenzivní a ostrá kampaň zbrzdila vývoj mikrobiologie nejméně o 20 let.

Wöhler a von Liebig zašli dokonce tak daleko, že ve svém vlastním časopise Annalen der Pharmacie začali publikovat anonymní satirické skeče, které zesměšňovaly mikroskopická pozorování. Právě ta sami vehementně odmítali. Skeč s názvem „Hádanka alkoholového kvašení vyřešena“ popisovala kvasinku pod mikroskopem jako malé zvířátko ve tvaru destilačního přístroje, polykající cukr a vylučující alkohol z konečníku a kyselinu uhličitou z pohlavního orgánu (viz obrázek dole).

Jistě se ptáte, proč tak vynikající vědci měli problém s přijetím výsledků svých kolegů a kvasince, coby živému organismu, upírali existenci. Jejich otevřené nepřátelství mohlo částečně vycházet z významných úspěchů, kterých oni sami, ale i další chemici dosahovali při zavádění organické chemie jako nové vědní disciplíny. Wöhler byl dokonce objevitelem jedné z prvních organických sloučenin vyrobených chemickými prostředky – močoviny z kyanitu amonného. A to se jim samozřejmě hodilo do karet, neboť mohli poslat ke dnu teorii, že organické látky, jako jsou například tuky a cukry, jsou spojené s živými organismy.

Justus von Liebig versus Louis Pasteur

V roce 1839 von Liebig publikoval rozsáhlou studii o kvašení, hnilobě a rozkladu a jejich příčinách. Kvašení označil za hnilobu rostlinného materiálu a učinil řadu dogmatických prohlášení. Krátce nato přišel se zcela mechanistickým vysvětlením kvašení: „Kvasinky v procesu chemického rozkladu uvolňují albuminovou látku do cukrového roztoku. Pak působením kyslíku ve vzduchu na tuto albuminovou látku, jejíž atomy jsou v násilném pohybu, přenášejí molekuly cukru, které se rozpadají na alkohol a oxid uhličitý.“ Jeho názory se však neopíraly o žádné experimenty.

Von Liebigova neoblomná pozice jej v roce 1857 svedla do slavné debaty s předním francouzským chemikem a mikrobiologem Louisem Pasteurem, který se naopak domníval, že kvasinky jsou živé mikroorganismy nezbytné pro průběh kvašení. Rozhodující ránu zasadil Pasteur Liebigovu konceptu, když prokázal, že kvasinky rostou v nepřítomnosti albuminových látek a že nejlépe kvasí cukr za nepřítomnosti kyslíku. Tento spor trval až do roku 1872.

Pravda zvítězí

Naštěstí první historickou procházku za objevením kvasinky a objasněním podstaty alkoholového kvašení nemusíme končit slovy o nepochopení a demagogickém potírání objevů podpořených důkazy, experimenty a neúnavnou prací prvních chemiků i biologů. Ačkoliv v 40. a 50. letech 19. století stále většina významných vědců zastávala von Liebigovu teorii, v době, kdy alkoholové kvašení začal zkoumat Louis Pasteur, se přece jen našli první vědci, kteří teorii živé kvasinky patřící do rostlinné říše vzali na milost.

* Poznámka: V textu se často objevuje slovo ferment. První vědci, kteří se hádankou alkoholového kvašení zabývali, tak obvykle nazývali látku, která se tvoří při kvašení. Například Pasterur za ferment označoval živý mikroorganismus, von Liebig tlející látku a Gay-Lussac zase produkt kvašení. Kvůli nejednoznačnosti byl tento termín později nahrazen slovem enzym.

Literatura a další zajímavé čtení:

• Barnett J. A. (1998). A History of Research on Yeasts 1: Work by Chemists and Biologists 1789–1850. Yeast 14: 1439–1451.
• Lavoisier A. L. (1789). Traité Élémentaire de Chimie. Cuchet, Paris (translated by R. Kerr, 1790, as Elements of Chemistry, Creech, Edinburgh).
• Meyen F. J. F. (1838). Jahresbericht über die Resultate der Arbeiten im Felde der physiologischen Botanik von dem Jahre 1837. Archiv für Naturgeschichte 4: 1–186.
• Quevenne T. A. (1838). Mémoire sur le ferment. Deuxième partie. De la fermentation alcoolique. Journal de Pharmacie et des Sciences Accessoires 24: 329–352.
• Quevenne T. A. (1838). Sur le ferment diabétique. Journal de Pharmacie et des Sciences Accessoires 24: 36–38.
• Rosenfeld L. (2003). Justus Liebig and Animal Chemistry. Clinical Chemistry 49: 1696–1707.
• Schwann T. (1837). Vorläufige Mittheilung, bettreffend Versuche über die Weingährung und
• Fäulniss. Annalen der Physik und Chemie 41: 184–193.
• Thenard L. J. (1803). Mémoire sur la fermentation vineuse. Annales de Chimie 46: 294–320.
• Turpin P. J. F. (1840). Mémoire sur la cause et les effets de la fermentation alcoolique et acéteuse. Mémoires de l’Académie Royale des Sciences de l’Institut de France 17: 93–180.